CDC20新突变的鉴定：女性不孕突变谱系的扩展
CDC20新突变的鉴定：女性不孕突变谱系的扩展
有个生育问题啊，听我慢慢给你们道来。首先，是这样滴，如果你年龄小于45岁，性生活正常，而且一年都没戴套还怀不上孕，那就需要注意了哦；其次，如果你已经尝试过两次试
有个生育问题啊，听我慢慢给你们道来。首先，是这样滴，如果你年龄小于45岁，性生活正常，而且一年都没戴套还怀不上孕，那就需要注意了哦；其次，如果你已经尝试过两次试管婴儿或者卵胞浆内单精子注射助孕，而失败的原因可能是母细胞成熟阻滞、受精失败或早期胚胎停滞。但是要先排除其他可导致不孕的男性因素、染色体异常、放疗或化疗等哦！ 下面咱们说说基因测序和筛选的事情。首先，我们用QIAamp DNA血液微量试剂盒从你的外周血中提取基因组DNA，然后使用SeqCap EZ Exome Kit对全外显子组进行捕获，接着在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。我们会将测序结果跟人类参考序列进行比较，还会注释突变，并进行功能预测哦！当然啦，对于来自血亲家庭的患者，我们还会做纯合子定位的分析，非常细致入微。最后，还会对候选突变进行筛选，并用先证者及其家人进行Sanger测序确认。接下来是TA**的构建。我们会从家系3的先证者基因组中扩增出复合杂合突变序列，然后再将其插入到pClone007载体中。这样做的目的就是为了构建一个表达载体。然后，我们从人类MI期*母细胞cDNA中扩增出野生型CDC20全长编码序列，再将其引入pCMV6空载体中。这一步需要使用KOD-Plus诱变试剂盒来诱导点突变。并且，在载体的C端插入一个FLAG标签，方便我们进行定位实验。紧接着是细胞培养和转染的步骤。我们会使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞），放在37摄氏度、5%CO2的湿式培养箱中。培养液是改良EAGLE培养液，其中含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。最后，我们会使用PolyJet体外DNA转染试剂将CDC20野生型和突变型载体转染到CHO细胞中。最后一个步骤是蛋白质印迹法。在转染前的一天，我们将CHO细胞接种到六孔板中，然后转染质粒。接着使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并通过BCA方法测定蛋白质浓度。等量的蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。总之就是一系列的实验和操作，希望对你们有所帮助哦！
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